Атлас трансляции и распада мРНК бактерий

Природная микробиология, том 8, страницы 1123–1136 (2023 г.) Процитировать эту статью

7989 Доступов

150 Альтметрика

Подробности о метриках

Регулирование стабильности информационной РНК имеет решающее значение для запрограммированной экспрессии генов у бактерий и достигается с помощью множества молекулярных механизмов. С помощью массового секвенирования 5'-монофосфорилированных промежуточных продуктов распада мРНК (5'P) мы показываем, что котрансляционная деградация мРНК консервативна как среди грамположительных, так и среди -отрицательных бактерий. Мы демонстрируем, что у видов с 5'-3'-экзонуклеазами экзорибонуклеаза РНКаза J отслеживает замыкающую рибосому, создавая in vivo однонуклеотидный отпечаток 5'-положения рибосомы. У других видов, лишенных 5'-3'-экзонуклеаз, расположение рибосом изменяет сайты эндонуклеолитического расщепления. Используя наш подход к секвенированию метадеградома (5'P деградома), мы охарактеризовали промежуточные продукты распада 5'P мРНК у 96 видов, включая Bacillus subtilis, Escherichia coli, Synechocystis spp. и Prevotella copri и выявить реакцию остановки рибосом на уровне кодонов и генов на стресс и медикаментозное лечение. Мы также применяем секвенирование 5'P к сложным клиническим и экологическим микробиомам и демонстрируем, что секвенирование метадеградома обеспечивает быструю, видоспецифичную посттранскрипционную характеристику ответов на лекарства или воздействия окружающей среды. Наконец, мы создали атлас деградома для 96 видов, чтобы можно было проанализировать механизмы деградации РНК у бактерий. Наша работа открывает путь к применению секвенирования метадеградома для исследования посттранскрипционной регуляции у некультивируемых видов и сложных микробных сообществ.

Деградация и трансляция информационной РНК (мРНК) тесно связаны, а изменения в динамике рибосом напрямую модулируют стабильность информационной РНК1,2,3,4. У эукариот синтез белка и распад мРНК связаны с помощью 5'-3'-экзонуклеазы Xrn1, которая следует за последней транслирующей рибосомой, создавая in vivo отпечаток ее положения5,6. Деградация РНК у бактерий позволяет адаптироваться к изменяющейся среде, но наше понимание деградации РНК у бактерий затруднено разнообразием механизмов деградации РНК. Считалось, что деградация бактериальной РНК инициируется эндонуклеолитическим расщеплением с последующей 3'-5'-деградацией7,8,9,10. Хотя сообщалось о экзонуклеолитической активности РНКазы J 5'-3' РНК у Bacillus subtilis11 и ее гомологов у других видов9, а эффективность трансляции модулирует стабильность мРНК у бактерий3,12, мы не понимаем, как котрансляционная деградация мРНК формирует бактериальную деградацию. degradome, или этот процесс различается у видов с разным механизмом деградации мРНК.

Чтобы лучше понять регуляцию биологии РНК у бактерий, мы исследовали деградацию мРНК в эталонных бактериальных штаммах и сложных микробиомах, используя оптимизированное секвенирование 5'-монофосфорилированных (5'P) промежуточных продуктов распада мРНК (деградом) (5PSeq). Мы исследовали степень, в которой встречающийся в природе 5'P отражает динамику рибосом in vivo, и охарактеризовали деградом 5'P в ответ на стресс окружающей среды и медикаментозное лечение в эталонных штаммах и сложных фекальных культурах. Мы проанализировали закономерности деградации мРНК у 96 культивируемых и некультивируемых видов, включая модельный организм B. subtilis, и сообщили о наших результатах здесь.

Мы проанализировали деградом 5'P мРНК у отдельных видов и сложных бактериальных сообществ, используя оптимизированный 5PSeq)5,13,14,15 (дополнительные таблицы 1 и 2 и методы). Сначала мы исследовали деградому 5'P открытых рамок считывания (ORF) у видов с распадом 5'–3'. B. subtilis кодирует 5’–3’ экзонуклеазу РНКазу J11. Хотя РНКаза J не гомологична эукариотическому XRN1, мы предположили, что благодаря ее 5'-3' экзонуклеазной активности она может «преследовать» последнюю транслирующую рибосому в мРНК, подвергающихся котрансляционному распаду, подобно XRN1 у дрожжей5,16. Наш анализ выявил 3-нуклеотидную (nt) периодичность отсчетов 5'P (рис. 1a) с предпочтением 5'P для второго нуклеотида каждого кодона (F1) как на метагенном, так и на уровне одного гена (рис. 1a). и расширенные данные (рис. 1а). Промежуточные продукты деградации 5'P накапливаются на 11 и 14 нт выше сайтов начала и остановки трансляции соответственно, как и ожидалось от медленных инициирующих и терминирующих рибосом. Этот паттерн аналогичен сайтам –14 нт от начала и –17 нт от конца у почкующихся дрожжей5,15. Этот меньший на 3 нт защитный размер можно объяснить известной разницей в размерах рибосом у эукариот и бактерий17. Мы подтвердили связь промежуточных продуктов распада 5'P с транслирующими рибосомами путем применения 5PSeq к полирибосомальным фракциям градиентов плотности сахарозы и наблюдали аналогичные закономерности (расширенные данные, рис. 1b). Чтобы продемонстрировать ее биологическое происхождение, мы подтвердили, что фрагментация той же РНК in vitro устраняет наблюдаемую in vivo периодичность 3 нт на >99,5% (сигнал быстрого преобразования Фурье (FFT) снижается до 0,11) и за счет отпечатков пальцев, связанных со старт/стоп (рис. 1а). Наконец, чтобы выяснить, играет ли роль РНКазы J в этом процессе, мы повторили анализ на штамме B. subtilis с делецией РНКазы JA (rnjA). Это показало, что активность РНКазы JA лежит в основе наблюдаемого паттерна распределения 5'P, возникающего в результате котрансляционной деградации мРНК (рис. 1b).